注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

原理是由一對(duì)引物介導(dǎo)，能在動(dòng)植物體外對(duì)特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝倍，使得檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
 特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對(duì)原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

人牙周膜成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL

胰蛋白酶-EDTA(含100mL酶解緩沖)10mL

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae小鼠肺大靜脈平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基

A3(人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞英文名稱：MS1

泡盛曲霉 Aspergillus awamori

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiaeCNE-2Z(人鼻咽細(xì)胞)

粘蛋白5AC(MUC5AC)重組蛋白英文名稱：Recombinant Mucin 5 Subtype AC (MUC5AC)

試劑耗材

人膀胱細(xì)胞英文名稱：EJ

土曲霉 Aspergillus terreus鼠李糖桿菌 Lactobacillus rhamnosus

鵝包柔氏螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒說明書解脂假絲酵母 Candida lipolytica食管

小鼠腺人絨毛間充質(zhì)成纖維細(xì)胞

大鼠表皮角化細(xì)胞*培養(yǎng)基異常漢遜酵母異常變種 Hansenula anomala var. anomala

銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa黃叉曲霉 Aspergillus flavo-furcatis

中慢生華癸根瘤菌 Mesorhizobium huakuii黑曲霉 Aspergillus niger

M1(小鼠白血病細(xì)胞)大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基

嗜熱鏈球菌 Streptococcus thermophilus釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

佛羅里達(dá)側(cè)耳 Pleurotus florida釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

小鼠垂體瘤細(xì)胞豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna

人神經(jīng)元細(xì)胞*培養(yǎng)基MuM-2C(人眼脈絡(luò)黑色素瘤細(xì)胞)

熒光假單胞菌 Pseudomonas fluorescens植物桿菌 Lactobacillus plantarum

單孢蟲道酵母 Ambrosiozyma manospora甘藍(lán)黑腐病禾谷類致病變種 Xanthomonas campestris pv. cerealis

HK-2, 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞大鼠肝星形細(xì)胞*培養(yǎng)基

中國臺(tái)灣根霉 Rhizopus formosensis青春雙歧桿菌 Bifidobacterium adolensentis

香菇 Lentinula edodes黑曲霉 Aspergillus niger

人胰腺細(xì)胞大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum

技術(shù)原理：
 DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。
       在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）
       發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。